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Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen

Das Forschungsprogramm "Molekulare Therapie bei Genodermatosen" hat die Entwicklung von Therapien für genetisch bedingte Hauterkrankungen zum Ziel. Der Hauptfokus liegt dabei auf Epidermolysis bullosa – der Krankheit, an der die "Schmetterlingskinder" leiden.

Epidermolysis bullosa (EB) ist eine Genodermatose, die durch Mutationen in für die Strukturproteine der Haut kodierenden Genen verursacht wird. Sind diese Strukturproteine qualitativ oder quantitativ beeinträchtigt oder fehlen komplett, kommt es bei geringsten mechanischen Belastungen zu Blasenbildung in der Haut und manchmal auch in Schleimhäuten.

Je nach Ebene der Spaltbildung werden verschiedene Subformen unterschieden. In der mildesten Form – EB simplex – kommt es zu einer Zytolyse der basalen Keratinozyten, verursacht durch Mutationen in z.B. KRT5, KRT14 oder PLEC. Die junctionale Form – EB junctionalis – ist durch eine Spaltbildung im Bereich der lamina lucida charakterisiert und wird hauptsächlich durch Mutationen in COL17A1 oder in den für LAM-332 kodierenden Ketten verursacht. Dystrophe EB ist durch eine Spaltbildung unter der lamina densa gekennzeichnet und entsteht durch Mutationen in COL7A1.

Fotos (6): R. Hametner

Mission



Epidermolysis bullosa (EB) ist eine seltene, genetische Hauterkrankung. Sie ist durch die Instabilität der Basalmembranzone (BMZ), einem komplexen Multiproteinkomplex, der die Haftung der oberen Hautschicht (Epidermis) an die darunterliegende Dermis gewährleistet, gekennzeichnet. Auslöser der Instabilität sind Mutationen in Genen, die für einzelne Proteine dieses Komplexes kodieren. Bisher sind 21 Gene bekannt, deren Veränderung zu verschiedenen Subtypen von EB führen. Allen Subtypen ist gemein, dass durch die Fragilität der Haut, Schleimhäute und anderer Gewebe schon nach geringer mechanischer Belastung (Reibung, Druck oder ein Trauma) Blasen und Wunden entstehen.

Durch unsere Forschung möchten wir effektive, evidenz-basierte, klinische Strategien zur Verfügung stellen, die die Lebensqualität unserer Patienten verbessern können. Dazu zählen sowohl Therapien, die auf wichtige pathobiologische Prozesse bei EB abzielen, als auch molekulardiagnostische Tests, die eine genaue Beurteilung des Krankheitsstatus ermöglichen und fundierte Behandlungsentscheidungen erleichtern. Unser vorrangigstes Ziel ist natürlich eine Heilung. Das bedeutet die Korrektur des genetischen Defekts, der für die Krankheit verantwortlich ist, auf genomischer Ebene und in jeder Zelle des Körpers eines Patienten. Dies stellt eine enorme Herausforderung dar. Durch die Implementierung neuester Technologien im Bereich des „gene-editing“ und deren kontinuierlichen Anpassung an die Bedürfnisse unserer Patienten, machen wir auf unserem Weg zu diesem Ziel bereits bedeutende Fortschritte.

Neben der inhärenten Instabilität der Haut können lokale und systemische Begleiterscheinungen von EB für die Patienten weitreichende Folgen haben. Bei RDEB (rezessiv dystrophe EB), einem der am schwersten betroffenen Subtypen, sind die größten Komplikationen die nicht heilenden Wunden und damit verbunden Juckreiz und Schmerzen. Diese stellen sowohl für den Patienten als auch für die Pflegenden eine hohe Belastung dar, die ihre Lebensqualität massiv beeinträchtigt. Außerdem können sich diese chronischen Wunden zu lebensbedrohlichen Plattenepithelkarzinomen entwickeln, die die Hauptursache für die reduzierte Lebenserwartung in dieser Patientengruppe darstellen.

Um diesen vielfältigen Herausforderung der Wundheilung und des Krebses entgegen zu treten zielt unsere Forschung darauf ab unbekannte und unterschätzte Faktoren aufzudecken, die zur Wundchronizität, malignen Transformation und Tumorprogression beitragen, um dieses Wissen für Diagnose und Therapie zu nutzen.

Diagnostik

Um eine Therapie für EB-Betroffene entwickeln zu können, muss zuerst einmal für jeden Patienten festgestellt werden, an welcher Subform er leidet, welches Gen betroffen ist und um welche Mutation(en) es sich handelt. Oftmals sind bei komplexeren Mutationsmustern weiterführende Analysen für das molekulargenetische Verständnis notwendig. Das Wissen um die Art der Genveränderungen ist auch wichtig, um eine Prognose für die Erkrankung erstellen zu können. Bei letalen Formen von EB wird betroffenen Familien eine spezielle Art der Analyse, die Pränataldiagnostik noch vor der Geburt, angeboten.

Als Methoden zur Mutationsanalyse verwenden wir die DNA-Isolierung aus Vollblut, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Vervielfältigung der gewünschten DNA-Bereiche und die Sequenzierung nach Sanger. Große Vorteile für Patienten und Forscher bietet seit 2015 auch die Panel-Sequenzierung der "Next Generation Sequencing" (NGS)-Methode, die präzisere Analysen in kürzerer Zeit mit weniger Kostenaufwand erlaubt.

Projekte:

Diagnostik: Mutationsanalyse, Molekulargenetische Analyse, Pränataldiagnostik
Mag. Alfred Klausegger

AG Koller

Designer-Nukleasen als Gentherapiewerkzeuge der Zukunft

Eine Gentherapie ist die einzige Möglichkeit, um die genetische Ursache einer Erkrankung zu beheben. Aufgrund ihrer Zugänglichkeit stellt die Haut ein ideales Zielorgan für eine gentherapeutische Anwendung dar. Die Genkorrektur kann dabei außerhalb (ex vivo) oder innerhalb (in vivo) des Körpers erfolgen. Aktuell wird die Entwicklung von Ex-vivo-Anwendungen forciert, da diese mit weniger Risiken verbunden sind. Grundsätzlich wird eine Ex-vivo-Behandlung wie folgt durchgeführt: über eine Hautbiopsie werden zunächst Stammzellen aus der Haut vom Patienten entnommen. Nachdem das mutierte Gen im Labor korrigiert wurde, werden die korrigierten Zellen zu vollständigen Hauttransplantaten expandiert. Diese werden dann auf die betroffenen Körperareale des Patienten zurücktransplantiert (siehe Abbildung). Die klassische Genersatztherapie, bei der das mutierte Gen durch eine gesunde Genkopie ergänzt wird, wurde bereits bei 3 Patienten mit der junktionalen Form der Epidermolysis bullosa (EB) erfolgreich angewandt.

 

 modifiziert nach Koller U, JATROS Dermatologie & Plastische Chirurgie, 2020; 1: 20-1.


Die Entdeckung bakterieller Nukleasen, die in der Lage sind, DNA Sequenzen gezielt anzusteuern und zu schneiden, bildete den Grundstein zur Entwicklung von neuer Technologien, die uns jetzt in die Lage versetzen, Erbschäden punktgenau zu korrigieren ohne das gesamte Gen einbringen zu müssen. Die Liste der genetischen Erkrankungen, für die Designer-Nukleasen gezielt als Gentherapie-Werkzeuge hergestellt werden wächst stetig. In den 1990er-Jahren wurden die ersten Designer-Nukleasen, die Zinkfingernukleasen, entwickelt und später aufgrund der erhöhten Effizienz und Spezifität durch TALENs („transcription activator-like effector nuclease“) bzw. in weiterer Folge durch die 2012 entdeckten CRISPR („clustered regularly interspaced short palindromic repeats“)/Cas9 („CRISPR associated protein 9“)-Nukleasen ersetzt. Der grundlegende Reparaturmechanismus der zur Korrektur der Erbschäden bzw. Mutationen führt, wird durch das spezifische Andocken der Nuklease im Bereich der genetischen Änderung initiiert. Es kommt in weiterer Folge zum Nuklease-vermittelnden Schneiden der DNA an dieser Stelle, wodurch verschiedene Reparaturmechanismen in der Zelle aktiviert werden. In den letzten Jahren machte sich unsere Arbeitsgruppe diese in der Zelle natürlich vorkommenden Reparaturmechanismen zu Nutze um auf unterschiedliche Weise die Genkorrektur zu bewerkstelligen. Neben der Stilllegung von Genen mit dominant negativen Mutationen und der Wiederherstellung des richtigen Leserahmens eines mutierten Gens, konnten wir sogar eine spurenlose Genkorrektur erreichen. Speziell die CRISPR/Cas9 Technologie wird bei uns im Labor aktuell für die Korrektur von verschiedenen EB-assoziierten Genen angewandt und stetig weiterentwickelt, um die Methode für eine etwaige Ex-Vivo-Gentherapie mittels korrigierten epidermalen Stammzellen am Patienten vorzubereiten.

 

 

Gruppenleitung:
PD Ulrich Koller, PhD

Teammitglieder:
Thomas Kocher, PhD
Stefan Hainzl, PhD
Johannes Bischof, PhD
Bernadette Liemberger, PhD

 

Team AG Koller

AG Pinon / Gruber

Ein Tumor wird oft als Wunde bezeichnet, die nicht heilt! Dies ist besonders für Patienten relevant, die an der seltenen Genodermatose, rezessiv dystrophe Epidermoylsis bulloa (RDEB) leiden. Deren chronische Wunden sind sehr anfällig für die maligne Umwandlung in lebensbedrohliche Plattenepithelkarzinome der Haut. Unsere Forschungsgruppe ist bestrebt, den schrittweisen Prozess der malignen Transformation von chronischer Wunden im Kontext der RDEB zu verstehen, mit dem übergeordneten Ziel, Strategien zu entwickeln, die die Lebensqualität unserer Patienten verbessern.

Unsere Forschung zeigte eine verringerte mikrobielle Diversität in RDEB-Wunden, die mit einer Zunahme pathogener Bakterienarten einhergeht und als direkte Konsequenz die Induktion endogener mutagener Prozesse auslösen und so zur Tumorentstehung beitragen. Die Daten unterstreichen, dass eine wirksame Wundversorgung eine antimikrobielle Komponente enthalten soll und von entscheidender Bedeutung ist, wenn wir das Krebsrisiko bei diesen Patienten senken wollen. Daher untersuchen wir Substanzen mit bekannten Wundheilungs- und antineoplastischen Eigenschaften, die eine schnelle Translation in klinische Studien für Patienten ermöglichen. Wir kombinieren molekulare und zelluläre Profiling-Techniken mit funktionalen Tests in klinisch-relevanten Modellen, um Marker zu identifizieren, die für Diagnose und Therapie genutzt werden können. Darüberhinaus entwickeln wir Strategien, die das Immunsystem nutzen, um den Krebs zu bekämpfen.

 

Gruppenleitung:
Josefina Piñón Hofbauer, PhD
Christina Guttmann-Gruber, PhD

Teammitglieder:
Anna Kaufmann, MSc
Victoria Leb-Reichl, PhD
Birgit Tockner, PhD
Tobias Welponer, MD 

AG Wally

Ein Hauptinteresse unserer Gruppe besteht in der Entwicklung von Therapien, die auf dem Einsatz von sogenannten “kleinen Wirkstoffen” (chemische Substanzen wie sie in einer Vielzahl von gängigen Medikamenten derzeit verwendet werden) beruhen. Solche Entwicklungen erfordern ein Verständnis der Epidermolysis bullosa (EB)-assoziierten Pathomechanismen. Während in den letzten Jahren große Fortschritte in der genotypischen Charakterisierung von Epidermolysis bullosa gemacht wurden, bestehen immer noch Lücken bei der Identifikation von nicht-genetischen Faktoren, die mit der hohen Variabilität der EB-Phenotypen in Zusammenhang stehen. Dies ist besonders relevant, da solche Faktoren auch potentielle therapeutische Targets darstellen können.

“Bench-to-bedside” Forschung für EB simplex:

Im Zuge der Erforschung von molekularen Signalwegen die zur spezifischen Ausprägung der dominant-vererbten EB simplex beitragen, konnten wir ein Modell entwicklen, das den Zusammenhang des EBS-Phänotyps mit spezifischen Mutationen und der Aktivierung des JNK-Signalweges zeigt. Dabei stellte Interleukin-1ß einen Schlüsselfaktor, und somit ein potentielles therapeutisches Target dar. Basierend auf präklinischen Daten, die den positiven Effekt einer auf IL-1ß abgezielten Behandlung in Keratinozyten zeigten, gelang es eine neue, topische Formulierung des Wirkstoffes Diacerein für klinische Applikationen zu entwickeln. Die Wirksamkeit dieser Salbe zeigte sich in der Reduktion von Blasenzahlen in einer klinischen Pilotstudie, sowie in einer Phase II/III Studie. Derzeit wird die Salbe in einer weltweiten, multizentrischen Phase III Studie getestet.

Einfluss von mikro-RNAs auf rezessiv-dystrophe EB:

Der Einfluss epigenetischer Regulation, insbesondere mikro (mi)-RNA-mediierte Regulationsmechanismen, steht derzeit im Zentrum unserer Forschung. Dabei soll der Einfluss von deregulierten miRNAs auf die EB Pathophysiologie und das Fortschreiten der Erkrankung analysiert werden, mit dem Ziel jene Mechanismen zu identifizieren, die mit der Entstehung hochaggressiver Plattenepithelkarzinome, die bei RDEB PatientInnen auftreten, in Zusammenhang stehen. Das hiermit assoziierte Ziel ist es Wege zu finden, diese miRNA-mediierten Signalwege zu modulieren. Dies kann entweder durch Einbringen oder Inhibierung einer miRNA geschehen, oder durch Regulation der miRNA-Expression, mit dem Ziel die Tumorentstehung zu stoppen, bzw. die Ausbreitung der Tumore zu bremsen.



Methoden zur Frühdiagnostik von RDEB-assoziierten Plattenepithelkarzinomen

RDEB-assoziierten Plattenepithelkarzinomen zeichnen sich durch besondere Aggressivität aus und sind die Hauptursache für die erhöhte Mortalität in dieser Patientengruppe. Da diese Tumore zumeist in chronischen und oftmals stark bakteriell besiedelten Wunden entstehen, ist eine frühzeitige Diagnose sehr schwer, da es kaum möglich ist bösartige Veränderungen in solchen Wunden zu erkennen. Allerdings ist eine möglichst frühe Diagnose entscheidend um diese extrem schnell wachsenden Tumore an einer unkontrollierten Ausbreitung (zumindest temporär) zu hindern. Daher ist es unser Ziel eine Methode zur Frühdiagnostik zu entwickeln, die auf der Detektion von tumorspezifisch deregulierten miRNAs beruht.


Gruppenleitung:

PD Verena Wally, PhD

Teammitglieder:
Thomas Lettner, PhD
Michael Ablinger, MSc
Monika Wimmer, MSc
Roland Zauner, MSc
Julia Illmer, Bakk. biol.
Matthias Brandlmaier, MD

Immunologie

Transplantationen gentherapeutisch korrigierter Haut haben das Ziel, anstatt von betroffenen Stellen (Wunden und/oder Blasen) stabile, "korrigierte" Haut zu erzeugen. In diesem Transplantat wird ein neues/korrektes Protein in die Haut eingebracht, was zu immunologischen Reaktionen führen kann. Das Risiko ist vor allem bei Betroffenen, denen das betroffene Protein initial durch die EB-Genveränderung in der Haut völlig fehlt, besonders groß, da das neu eingebrachte Protein (Neo-Antigen) als "fremd" erkannt werden kann. Die dadurch gestartete Immunreaktion kann dazu führen, dass das ganze transplantierte Gewebe abgestoßen (= zerstört) wird.

Es ist uns gelungen, ein neues Mausmodell zu entwickeln, in welchem wir gezielt diese Immunreaktionen gegen ein bekanntes Neo-Antigen untersuchen und manipulieren können. Wir verwenden dieses Mausmodell nun zur Entwicklung von Methoden, das Immunsystem zu bremsen. 2014 haben wir unter anderem die Anwendung der so genannten "IL-2 Komplex"-Therapie begonnen. Diese kann so genannte regulatorische oder Suppressor-T-Zellen (die "Bremser-Zellen" des Immunsystems) vermehren, welche die Immunreaktion gegen das Neo-Antigen in der Haut abschwächen und somit das transplantierte Hautgewebe schützen. In unseren ersten Experimenten konnten wir eine Vermehrung dieser Suppressor-Zellen erreichen und bereits erste positive Effekte auf Hauttransplantate erzeilen. Derzeit untersuchen wir, welche zusätzlichen Faktoren für den Erhalt der Transplantate wichtig sind. Wir werden diese Frage in unseren präklinischen Studien im Mausmodell testen.

Weiters arbeiten wir an der Entwicklung eines zweiten Mausmodells, welches das Immunsystem einzelner Patienten nachbilden kann (die so genannte "Mini Me"-Maus oder "Kleines-Ich"-Maus). Damit soll untersucht werden, wie Patienten auf ein Transplantat reagieren würden, und abgeklärt werden, welche Therapieansätze am effizientesten sind.

In einem dritten Teil unserer Forschung untersuchen wir während einer laufenden Gentherapie die Immunreaktion von EB-Betroffenen auf das Transplantat.

Projekte:

Vermehrung regulatorischer T-Zellen zur Suppression der Immunreaktion gegen ein Neo-Antigen in einem Haut-Transplantat
Sophie Kitzmüller, MSc, Dr. Iris Gratz

Entwicklung eines neuen Mausmodells zur Untersuchung patienten-spezifischer Immun-Reaktionen nach einer ex-vivo-Gentherapie
Maria M. Klicznik, MSc, Dr. Eva Murauer, Dr. Iris Gratz

Immunreaktion auf funktionelles Laminin332 (LAM5) im Zuge einer EB-Gentherapie
Raimund Holly, MSc

Team und Kontakt

Univ.-Prof. Dr. Johann Bauer, MBA
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Intermistischer Leiter

Tel.: +43 57255-57838
Tel.: +43 57255-24600

E-Mail: joh.bauer@salk.at
Publikationen
Dr. Elisabeth Mayr
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Forschungskoordination

Tel.: +43 (0) 57255-82413
E-Mail: el.mayr@salk.at
Publikationen
Dr. Sigrid Arming
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Qualitätsmanagement

Tel.: +43 (0) 57255-82414
E-Mail: s.arming@salk.at
Dr. Pamina Schlager
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Qualitätsmanagement

Tel.: +43 (0) 57255-82414
E-Mail: p.schlager@salk.at
Publikationen
Mag. Alfred Klausegger
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Labormanager

Tel.: +43 (0) 57255-58294
E-Mail: a.klausegger@salk.at
Publikationen
Michael Ablinger, MSc
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftlicher Mitarbeiter

Tel.: +43 (0)57255-82407
E-Mail: m.ablinger@salk.at
Publikationen
Dr. Christina Gruber
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-82412
E-Mail: c.gruber@salk.at
Publikationen
Dr. Stefan Hainzl
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftlicher Mitarbeiter

Tel.: +43 (0) 57255-80932
E-Mail: s.hainzl@salk.at
Publikationen
Dr. Thomas Kocher
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftlicher Mitarbeiter

Tel.: +43 (0) 57255-80932
E-Mail: t.kocher@salk.at
Publikationen
Dr. Ulrich Koller
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftlicher Mitarbeiter

Tel.: +43 (0) 57255-80930
E-Mail: u.koller@salk.at
Publikationen
Dr. Eva Murauer
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

E-Mail: e.murauer@salk.at
Publikationen
Dr. Josefina Pinon-Hofbauer
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-82412
E-Mail: j.d.pinon@salk.at
Publikationen
Dr. Victoria Reichl
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-82414
E-Mail: v.reichl@salk.at
Publikationen
Dr. Birgit Tockner
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-82412
E-Mail: b.tockner@salk.at
Publikationen
Dr. Bernadette Liemberger
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-80933
E-Mail: b.liemberger@salk.at
Publikationen
Dr. med. univ. Tobias Welponer Fries
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Dissertant

Tel.: +43 (0) 57255-82412
E-Mail: tobias.welponer@alumni.pmu.ac.at
Publikationen
Dr. Johannes Bischof
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftlicher Mitarbeiter

Tel.: +43 (0) 57255-80931
E-Mail: j.bischof@salk.at
Roland Zauner, MSc
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftlicher Mitarbeiter

Tel.: +43 (0) 57255-82412
E-Mail: rolan.zauner@salk.at
Publikationen
Anna Kaufmann, MSc
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-82412
E-Mail: an.kaufmann@salk.at
Publikationen
Monika Wimmer, MSc
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-82412
E-Mail: mo.wimmer@salk.at
Publikationen
Dr. Thomas Lettner
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftlicher Mitarbeiter

Tel.: +43 (0) 57255-82414
E-Mail: t.lettner@salk.at
Publikationen
Dr. Verena Wally, Ph.D.
Forschungsprogramm für Molekulare Therapie bei Genodermatosen
Wissenschaftliche Mitarbeiterin

Tel.: +43 (0) 57255-82405
E-Mail: v.wally@salk.at
Publikationen