Regulation kardialer Hypertrophiemechanismen durch Cullin-RING Ubiquitinligasen

Das Ubiquitin-Proteasomen-System (UPS) ist ein wichtiger Regulationsmechanismus der zellulären Signaltransduktion und an der Pathogenese verschiedener Herzerkrankungen beteiligt (Zolk et al. Cardiovasc Res 2006). Cullin-RING-Ubiquitinligasen (CRLs) bilden die größte Gruppe der E3 Ubiquitinligasen und nutzen F-Box-Proteine für die Substraterkennung (Sarikas et al., Genome Biol 2012). Von den 69 F-Box-Proteinen, die durch das menschliche Genom kodiert werden, sind nur ein Bruchteil im Herzen untersucht (Spaich et al., Circ Res 2012).

Wir nutzen ein breites Spektrum von in vivo (Mausgenetik) und in vitro Methoden (Molekular- und Proteinbiochemie), um die Rolle des Ubiquitin-Proteasomen-Systems für die Regulation kardialer Signalwege zu untersuchen. Schwerpunkt ist die Identifikation Hypertrophie-modulierender CRLs in Kardiomyozyten mittels siRNA Screening und deren molekularbiologische und physiologische Charakterisierung im Rahmen der adaptiven und maladaptiven Hypertrophie des Herzens.

Zentrale Publikationen

Xu X, Sarikas A, Dias-Santagata DC, Dolios G, Lafontant PJ, Tsai SC, Zhu W, Nakajima H, Nakajima HO, Field LJ, Wang R, Pan ZQ. The CUL7 E3 ubiquitin ligase targets insulin receptor substrate 1 for ubiquitin-dependent degradation. Mol Cell. 2008; 30: 403-414.

Xu X, Keshwani M, Meyer K, Sarikas A, Taylor S, Pan ZQ. Identification of the degradation determinants of insulin receptor substrate 1 for signaling cullin-RING E3 ubiquitin ligase 7- mediated ubiquitination. J Biol Chem. 2012; 287: 40758-40766.

Charron MJ, Pan ZQ, Engelhardt S, Sarikas A. Evidence for a regulatory role of Cullin-RING E3 ubiquitin ligase 7 in insulin signaling. Cell Signal. 2014; 26: 233-239.

Hartmann T, Xu X, Kronast M, Muehlich S, Meyer K, Zimmermann W, Hurwitz J, Pan ZQ, Engelhardt S, Sarikas A. Inhibition of Cullin-RING E3 ubiquitin ligase 7 by simian virus 40 large T antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014; 111: 3371-3376.

Modulation der kardialen Fibrogenese durch zelluläre Seneszenz

Der bindegewebige Umbau des Herzmuskels (Herzfibrose) ist ein Kennzeichen zahlreicher Herzerkrankungen und ist mit einer signifikant erhöhten Mortalität assoziiert (Leask, Circ Res 2015). Der genaue molekulare Ablauf dieses Prozesses ist noch weitgehend ungeklärt, eine kausale Therapie nicht vorhanden. Neuere Studien identifizierten die vorzeitige Zellseneszenz (premature senescence) als wichtigen Regulator der Leber- und Hautfibrose (Krizhanovsky et al., Cell 2008; Jun et al., Nat Cell Bio 2010). Seneszente Zellen sind durch einen p16INK4a und/oder p53/p21CIP1/WAF1 vermittelten irreversiblen Zellzyklusarrest, erhöhte Expression des Enzyms beta-Galaktosidase (SA-beta-Gal), eine abnorme Zellmorphologie sowie verändertes Sekretom gekennzeichnet (Tchkonia  et al., J Clin Invest. 2013).

Durch Verwendung verschiedener Tiermodelle der kardialen Fibrose sowie von humanen Herzbiopsien konnten wir zeigen, dass der Fibrosierungsprozess im Herzmuskelgewebe mit dem Auftreten vorzeitiger Zellseneszenz verbunden ist (Meyer et al., J Am Coll Cardiol 2016). Ziel unserer weiteren Forschungsarbeiten ist es, die molekularen Mechanismen der Zellseneszenz im Mikroenviroments des Myokards zu untersuchen.

Zentrale Publikation

Meyer K, Hodwin MS, Engelhardt, S, Sarikas A. Essential role for premature senescence of myofibroblasts in restraining cardiac fibrosis J Am Coll Cardiol. 2016;67:2018-2028.

Neue Lehrmedien in der Medizin / Learning analytics

Das Internet und die Omnipräsenz mobiler Endgeräte eröffnen neue didaktische Möglichkeiten für die Hochschullehre. Wir untersuchen mittels quantitativer (Umfragen) und qualitativer (Fokusgruppen, Interviews) Methoden die Prävalenz und Nutzung digitaler Lernmedien bei heutigen Studierenden und deren Potential und Limitationen für Wissenserwerb und -transfer. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt ist das Erheben, Analysieren und Auswerten von digitalen Daten im Lernkontext (Learning analytics).

Ziel ist die evidenzbasierte Entwicklung von Analysealgorithmen, um den Wissensstand und Lernfortschritt der Studierenden dynamisch zu messen, potentielle Problembereiche aufzudecken und so zur Optimierung des Lehr-/Lernprozesses beizutragen.

Zentrale Publikationen

Kühbeck, F; Berberat, PO; Engelhardt, S; Sarikas, A. Correlation of online assessment parameters with summative exam performance in undergraduate medical education of pharmacology: a prospective cohort study. BMC Med Educ. 2019; 19(1):412

Gutmann J, Kühbeck F, Berberat PO, Fischer MR, Engelhardt S, Sarikas A. Use of learning media by undergraduate medical students in pharmacology: a prospective cohort study. PLoS One. 2015;10:e0122624

Kräenbring J, Monzon Penza T, Gutmann J, Muehlich S, Zolk O, Wojnowski L, Maas R, Engelhardt S, Sarikas A. Accuracy and completeness of drug information in wikipedia: a comparison with standard textbooks of pharmacology. PLoS One. 2014;9:e106930.

Kühbeck F, Engelhardt S, Sarikas A. OnlineTED.com - a novel web-based audience response system for higher education. A pilot study to evaluate user acceptance. GMS Z Med Ausbild. 2014; 31: Doc5.

Genetische und molekulare Determinanten des erblichen Hörverlusts

Ein weiterer Forschungsschwerpunkt des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie ist das Verständnis der genetischen und molekularen Mechanismen des syndromalen (Pendred-Syndrom) und des nicht-syndromalen malformativen Hörverlusts. In Zusammenarbeit mit der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde (Prof. G. Rasp und Dr. S. Rösch) der Salzburger Landeskliniken (SALK) haben wir die erste österreichische Kohorte von Patienten mit Hörverlust mit vergrößertem vestibulären Aquädukt (EVA) untersucht, einer der häufigsten Ursachen des sensorineuralen Hörverlusts (Roesch et al., Int J Mol Sci 2018). Das SLC26A4-Gen, das für den Anionenaustauscher Pendrin kodiert, ist häufig bei Patienten mit Pendred-Syndrom und nicht-syndromischem EVA mutiert.

Ziel der Forschung ist ein genaueres Verständnis der molekularen Störungen, die zum Verlust der Funktion pathogener Varianten des Pendrin-Proteins führen, einschließlich struktureller Änderungen, zellulärer Fehllokalisierung, gestörtem Proteinumsatz und veränderter Gentranskription (Pera und Dossena, PNAS 2008; Dossena et al. Cell Physiol Biochem. 2011). Der mögliche Beitrag weiterer Gene, einschließlich der Connexine GJB2, GJB3 und GJB6, sowie Transkriptionsfaktoren bei der Bestimmung von malformativem Hörverlust wird ebenfalls untersucht. Ziel ist es, Strategien für die Entwicklung zukünftiger Therapien zu identifizieren.

Das Institut für Pharmakologie und Toxikologie besitzt die vom Bundesministerium für Arbeit, Soziales, Gesundheit und Konsumentenschutz (Österreich) erteilte Zulassung zur diagnostischen Genanalyse (Zulassungsnummer: BMASGK-76120/0007-IX / B / 16c / 2018). Die analysierten Gene sind GJB2, GJB6, SLC26A4 und POU3F4, die alle eine fundamentale Rolle bei der Pathogenese des sensorineuralen Hörverlusts spielen, die mit Fehlbildungen des Innenohrs zusammenhängt.

Zentrale Publikationen

Roesch, S; Bernardinelli, E; Nofziger, C; Tóth, M; Patsch, W; Rasp, G; Paulmichl, M; Dossena, S; Functional Testing of SLC26A4 Variants-Clinical and Molecular Analysis of a Cohort with Enlarged Vestibular Aqueduct from Austria. Int J Mol Sci. 2018; 19(1):

Pera A, Dossena S, Rodighiero S, Gandía M, Bottà G, Meyer G, Moreno F, Nofziger C, Hernández-Chico C, Paulmichl M. Functional assessment of allelic variants in the SLC26A4 gene involved in Pendred syndrome and nonsyndromic EVA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:18608-18613.

Dossena S, Bizhanova A, Nofziger C, Bernardinelli E, Ramsauer J, Kopp P, Paulmichl M. Identification of allelic variants of pendrin (SLC26A4) with loss and gain of function. Cell Physiol Biochem. 2011;28:467-76.

Rolle posttranslationaler Modifikationen von Proteinen bei Stoffwechselstörungen

In diesem Forschungsprojekt wird die Rolle von O-GlcNAcylierung von Proteinen bei Stoffwechselkrankheiten untersucht. Die O-GlcNAcylierung beinflusst Proteinfunktion, -stabilität, die subzelluläre Lokalisation sowie die Protein-Protein-Interaktion (Fisi et al., 2018). O-GlcNAcylierungslevel vieler Zellproteine sind bei Patienten mit Diabetes mellitus erhöht und tragen zur Beeinträchtigung grundlegender zellulärer Funktionen und der Pathogenese diabetischer Komplikationen bei. Ziel unserer Forschung ist es, weitere zelluläre Funktionen zu identifizieren, die durch O-GlcNAcylierung kontrolliert und möglicherweise verändert werden. Außerdem möchten wir verstehen, ob die O-GlcNAcylierung und die zellulären Spiegel der Enzyme, die die O-GlcNAcylierung steuern, nützliche diagnostische Marker für die frühzeitige Diagnose und Überwachung des Fortschreitens von Prä-Diabetes, Diabetes und diabetischen Komplikationen darstellen können.

Zentrale Publikation

Fisi, V; Katai, E; Orban, J; Dossena, S; Miseta, A; Nagy, T. O-Linked N-Acetylglucosamine Transiently Elevates in HeLa Cells during Mitosis. MOLECULES. 2018; 23(6): 1275

Wir legen größten Wert auf exzellente Lehre. Als Kerninstitut der Paracelsus Medizinischen Privatuniversität unterrichten wir vollumfänglich die Fachgebiete Allgemeine und Spezielle Pharmakologie und Toxikologie sowie Klinische Pharmakologie und Pharmakotherapie für die Studiengänge Humanmedizin, Pharmazie sowie den postgraduellen Studiengang Molekulare Medizin.

Darüber hinaus entwickelt das Institut für Pharmakologie und Toxikologie international genutzte und ausgezeichnete Online-Lehrangebote für Pharmakologie, sowie Smartphone-basierte Lehrtools und eine Online-Plattform für das Lernprozessmonitoring exmatrikulationsgefährdeter Studierender. In Zusammenarbeit mit der Technischen Universität München betreiben wir Pharmacases.de, eine Peer-Teaching- und Open Access-E-Learning-Plattform für Pharmakologie (Zollner et al., Med Teach 2013). Prof. Sarikas und sein Team entwickelte OnlineTED.de, ein innovatives webbasiertes Abstimmungssystem für Bildungseinrichtungen (Kühbeck et al., GMS Z Med Ausbild. 2014).

Online-Lehrangebote des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie:

• Peer-Teaching- und E-Learningprojekt Pharmacases www.pharmacases.de
• Wirkstoffliste PMU300 www.pmu300.at
• Abstimmungsystem OnlineTED www.onlineted.de

Das Institut für Pharmakologie und Toxikologie bietet folgende Lehrveranstaltungen an der Paracelsus Medizinischen Privatuniversität in Salzburg an:

Diplomstudiengang Humanmedizin:

• Vorlesung "Pharmakologie und Toxikologie"
• Vorlesung und Seminar "Wissenschaftliche Kompetenz"

Bachelorstudiengang Pharmazie:

• Vorlesung "Allgemeine Pharmakologie A"
• Vorlesung "Allgemeine Pharmakologie B"
• Seminar "Pharmakovigilanz"

Postgraduierten-Doktoratsstudium Medizinische Wissenschaft (Ph.D.):

• Vorlesung "Pharmakologie"
  
  

Das Institut für Pharmakologie und Toxikologie bietet folgende Methoden und Analysen im Rahmen wissenschaftlicher Kollaborationsprojekte für akademische Einrichtungen und Firmen an:

Elektrophysiologie Einheit

Moderne Patch-Clamp-Einheit, bestehend aus einem EPC 10 USB-Verstärker (HEKA, Deutschland), einem pneumatischen Vibrationsschutztisch, einem piezoelektrischen Mikromanipulator (Scientifica) und einem inversen Phasenkontrastmikroskop (Motic AE31) mit Fluoreszenz- und FITC- und TRITC-Emissionsfilter zur Identifizierung transfizierter Zellen, Perfusionssystem mit ALA VC4-Ventilsteuerung und Vakuumpumpe, Macintosh-Computer, auf dem die Erfassungssoftware PatchMaster ausgeführt wird. Die Benutzer haben Zugang zu einem horizontalen Abzieher (Sutter Instruments) und einer Mikroforge (Narishige) zum Bau von Elektroden sowie zu einem Zellkulturraum der Biosicherheitsstufe II.

Weitere Informationen

Molekulare Bildgebung

Echtes konfokales System, ausgestattet mit 4 Lasern (Diode, Argon, DPSS, Helium / Neon) mit 8 Anregungslinien (405, 458, 476, 488, 496, 514, 561, 633 nm), konventioneller und resonanter Scanner für schnelle Aufnahmegeschwindigkeit akustooptischer Strahlteiler (AOBS) zur besseren Übertragung des emittierten Lichts, akustooptisch abstimmbarer Filter (AOTF) zur Feinsteuerung der Laserleistung, 3 Photomultiplier (PMTs) mit Spektraldetektoren zur freien Wahl des Emissionsfensters und ein Hybrid Detektor (hyD) zur optimalen Signal-Rausch-Verhältnis-Erfassung im roten Emissionsbereich, 5 Objektive (10x, 20x, 40x und zwei 63x) einschließlich eines 63x-Immersionsobjektivs zur Abbildung lebender Proben, Temperatur-, Feuchtigkeits- und CO2-Kontrolle. Das konfokale Mikroskop befindet sich in einem Laborraum für Biosicherheitsstufe II, der mit einer Hood für die Biosicherheitsstufe II, einem Inkubator für Zellkultur, einem Kühlschrank, einem Gefrierschrank, einer kleinen Dunstabzugshaube und einem System mit entionisiertem Wasser des Typs III ausgestattet ist.

Weitere Informationen

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Assay

Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) Assays bestimmen Prävalenz und den Genotyp eines oder mehrerer SNPs in einer Patientenkohorte. Hierzu wird genomische DNA durch eine automatisierte EZ1 Advanced XL-Plattform (Qiagen) aus nicht mehr als 350 ul peripherem Blut extrahiert und mittels Realtime-PCR mit allelspezifischen Primern und einem sondenbasierten Reportersystem auf dem Rotor Gene Q (QIAGEN) analysiert. 72 Proben können gleichzeitig analysiert werden.  

Untersuchung der subzellulären Lokalisierung und Protein-Protein-Interaktion

Die Untersuchung der Proteinexpression in einem subzellulären Kompartiment oder die Kolokalisierung von zwei oder mehr Proteinen in der Zelle sind nützliche Strategien zur Aufklärung von Proteinfunktion, Interaktion und zellulärem Proteintrafficking. Die Die Kolokalisierung von nativen oder rekombinanten Proteinen in lebenden oder fixierten Zellen wird quantifiziert und statistisch ausgewertet, um Unterschiede zwischen Proteinvarianten oder verschiedenen Bedingungen aufzudecken. Marker von Zellkompartimenten wie Zellkern, Plasmamembran, endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Komplex, Mitochondrien und Autophagosomen ermöglichen die Identifizierung des spezifischen subzellulären Kompartiments eines Proteins. Die molekulare Bildgebung wird mit einem konfokalen Leica TCS SP5 II-Mikroskop durchgeführt, das mit 4 Lasern und 8 Anregungswellenlängen (405, 458, 476, 488, 496, 514, 561, 633 nm) ausgestattet ist.